RNA提取

实验介绍

细胞中与蛋白质合成相关的RNA可以分为信使RNA（mRNA）、转运RNA（tRNA）和核糖体RNA（rRNA）三大类。不同组织总RNA提取的实质就是将细胞裂解，释放出RNA，并通过不同方式去除蛋白质、DNA等杂质，最终获得高纯度RNA产物的过程。获得纯度高、完整性好的RNA，对后续的实验至关重要。

相关原理

• 什么是RNA

  核糖核酸（Ribonucleic Acid，简称RNA）是一种存在于生物细胞以及部分病毒、类病毒中的遗传信息载体，是由核糖核苷酸通过磷酸二酯键连接而成的长链聚合分子。这种聚合分子，在基因的编码、解码、调节和表达中具有多种生物学作用。与DNA一样，RNA组装成一条核苷酸链，但与DNA不同的是，绝大部分在自然界中发现的RNA是一条折叠在其自身上的单链，而不是一对双链。细胞有机体使用信使RNA（mRNA）来传达指导特定蛋白质合成的遗传信息（使用鸟嘌呤、尿嘧啶、腺嘌呤和胞嘧啶的含氮碱基，由字母G、U、A和C表示）。许多病毒使用RNA基因组编码其遗传信息。RNA包括mRNA（信使RNA）、rRNA（核糖体RNA），rRNA（核糖体RNA），miRNA（小RNA），lncRNA（长链非编码RNA），circRNA（环状RNA）。

  

• RNA提取实验
  • 硫氰酸胍法和Trizol法是动物组织及动物细胞总RNA提取最常用的方法，异硫氰酸胍法操作简单快捷，适用于样本足够大的常规动物组织；Trizol法裂解能力较强，尤其适合小样本及特别难提取的组织。另外Trizol作为一种通用型的裂解试剂，还可以用于植物组织、细菌、真菌等组织的提取。对于含多糖多酚的植物组织如油茶、茶叶、油菜等还可以使用CTAB法进行总RNA的提取。
  • 用Trizol 的溶液提取，将总RNA与 DNA 和蛋白质分离。Trizol 是一种酸性溶液，含有硫氰酸胍 (GITC)、苯酚和氯仿。GITC 不可逆地使蛋白质和 RNase 变性。随后进行离心。在酸性条件下，总 RNA 保留在上层水相中，而大部分 DNA 和蛋白质保留在中间相或下层有机相中。然后通过用异丙醇沉淀回收总 RNA。RNase 酶可以通过加入吡咯碳酸二乙酯 (DEPC) 来灭活。
• 相关试剂的作用：
  • 苯酚的主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白，核酸物质解聚得到释放。苯酚虽可有效地变性蛋白质，但不能完全抑制RNA酶活性，因此Trizol中还加入了8－羟基喹啉、异硫氰酸胍、β-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase（RNA酶）。
  • 异丙醇通过-OH的疏水作用使得RNA 或者DNA链中的亲水基团受到保护，等同于沉淀。
  • 氯仿一方面变性蛋白质，另一方面加入水相和有机相的分离。下层，苯酚-氯仿相，上层是水相，中间为蛋白相。
  • 75% 乙醇是起到洗涤的作用，一方面却可以溶解一些沉淀中可能的有机无杂质，另一方面可以洗掉异丙醇、氯仿试剂，还可以溶解一部分蛋白质。
• 其他
  • 经典Trizol法会选择性丢失低GC比的miRNA。
  • DEPC并不是万能的，尤其是无法处理含有Tris、HEPES等含胺类的溶液，除非加到很高的浓度。

实验流程

以下实验流程为参考，请严格按照试剂盒的说明书操作

• 材料的处理
  • 组织：每 100 毫克新鲜组织加入 1 毫升 TRIzol 试剂，使用无菌手术刀在冰上切碎，并用无菌匀浆器或其他设备匀浆。
  • 细胞：如果是细胞培养物，应在从培养箱中取出后立即进行处理。细胞在室温（15-25 ºC）下以 1000rpm 离心5 分钟，然后丢弃上清液或从单层生长的细胞中去除培养基，用预冷PBS洗一次。每 1 × 10<7> 细胞加入 1 ml Trizol 试剂。
• 提取流程

  1. 4°C 预冷离心机

  2. 将组织或细胞裂解液转移到 1.5毫升无RNA酶EP管中。置冰上，静置 5 分钟。

  3. 每管加入200ul氯仿，充分混合后冰上静置10分钟，使核蛋白复合物完全解离。

  4. 在 4°C 下以 13000 rpm离心 15 分钟。期间，取一新EP管，加入500ul异丙醇，冰上预冷。

  5. 离心后，将上层水相 (约500 ul) 转移到该新的 EP管中。

  6. 冰上静置，酒精沉淀10min。

  7. 离心， 13000 rpm， 10 分钟。

  8. 去除上清液。用 1ml 75% 乙醇洗涤 RNA 沉淀一次。

  9. 12000rpm离心 5 分钟。

  10. 去掉上清，风干或真空干燥 RNA 沉淀 5-10 分钟。

  11. 将 RNA 溶解在30-50ul DEPC 处理过的去离子水中（需根据RNA沉淀的量加水溶解）。

  12. 进行分光光度分析以确定样品浓度和纯度。

• 注意事项

  1. 避免污染

  2. 为避免RNase等污染，可以在操作前仔细清洁实验平台、试剂盒、器皿和工具等，并使用经清洗的试剂和器皿。此外，应该尽可能快地进行样品提取，以减少RNA降解和污染的可能性。

  3. 明确目的和选择合适的方法

  4. 不同的样本类型有不同的组织结构和特征，因此需要根据实验目的和样本类型选择合适的RN提取方法。

  5. 优化样品破碎步骤

  6. 样品破碎对RNA提取至关重要。不同样品类型需要不同的破碎方法，如高压均质机、超声波等。在破碎过程中，需要注意破碎时间和功率控制，以避免过度破碎导致RNA的降解。细胞破碎方法：超声波法、高压均质法、玻璃珠法等都是常用的细胞破碎方法。

  7. 温度控制

  8. RNA在高温下易于分解，因此在提取RNA时要控制好温度。在冷冻样品之前，通常建议在低温环境中培养细胞或收集组织，以最大程度地保护RNA。

  9. RNA/DNA保存

  10. RN应该储存在-80℃冰箱中，以避免降解和污染。在长期储存之前，建议进行浓缩，并将RNA用RNase-free水稀释至合适的浓度。

仪器耗材

1. 试剂

   氯仿，苯酚，异丙醇溶液，无RNA酶水，75%乙醇。

2. 仪器

   移液枪，超净台，涡旋器，冷冻离心机

运用

通过总RNA提取可获得高纯度及高质量的总RNA，可用于实时荧光定量PCR、Northern blot、microRNA检测、芯片分析, DNA文库构建,基因克隆等实验。